L’immunoistochimica è un metodo complesso e altamente specifico per la rilevazione di determinati antigeni presenti nel tessuto o nelle cellule da esaminare. Su una sezione di tessuto o su cellule opportunamente preparate, si pone l’anticorpo specifico per l’antigene che stiamo cercando. Avremo, in questo modo, una reazione immunitaria antigene-anticorpo che sarà successivamente rivelata da un anticorpo secondario coniugato ad un enzima catalizzatore (ad es. perossidasi) che reagisce con un substrato (cromogeno, ad es. DAB, FAST RED-TR) formando un precipitato insolubile colorato visibile al microscopio ottico.
Come metodi di rilevazione si possono usare, a seconda del materiale a disposizione o della tematica da sviluppare, i seguenti metodi:

• Metodo diretto. Si parte da un anticorpo specifico legato alla perossidasi (enzima catralizzatore) che, applicato al tessuto, si legherà specificamente all’antigene permettendo la successiva rivelazione mediante un substrato cromogeno (DAB marrone, FAST-RED rosso, BPIC blu). La tecnica di immunoistochimica diretta è generalmente molto veloce e con scarse possibilità di reazione non specifica. Il principale inconveniente è rappresentato dal fatto che per ogni antigene che deve essere localizzato è necessario un anticorpo coniugato differente. Questo metodo è generalmente usato per la determinazione di immunoglobuline complementari e immunocomplessi presenti in campioni istologici renali e muscolari di pazienti con Lupus Eritematoso Sistemico (SLE).
• Metodo indiretto. Un anticorpo primario ottenuto da animale (ratto, topo, coniglio) viene fatto reagire con l’antigene eventualmente presente su una sezione di tessuto. Successivamente si aggiunge un anticorpo secondario coniugato specifico per gli anticorpi dell’animale usato in precedenza (ratto, topo o coniglio) e che poi, mediante un substrato colorato, viene rivelato. Questo metodo è molto più versatile di quello diretto perchè una varietà di anticorpi primari provenienti dalla stessa specie animale possono essere usati con un solo anticorpo secondario coniugato.

Il metodo diretto prevede un rapporto antigene-catalizzatore di uno a uno, determinando una certa quantità di substrato colorato alla fine della reazione. Il metodo indiretto, invece, presenta un rapporto antigene-catalizzatore diverso (fino 1 a 16) in quanto più anticorpi secondari ed anche terziari si legano all’anticorpo primario (procedura definita amplificazione del segnale) associando così un numero maggiore di catalizzatori all’antigene. Questo risulta in una maggior quantità di substrato colorato alla fine della reazione, rendendo l’antigene più evidente.

Figura S31. Esempio schematico di reazione immunoistochimica diretta (a sinistra) e indiretta (a destra).

Figura S32. Cornea di topo. Reazione immunoistochimica HPR-Streptavidina-Biotina contro la E-Caderina che si colora in marrone intenso con il DAB. 200x

Figura S33. Intestino fetale umano. Colorazione immunoistochimica che mette in evidenza in marrone intenso i fasci di muscolatura liscia in via di formazione.