Le colorazioni istochimiche danno informazioni, più che sull’aspetto morfologico del preparato, sul contenuto e sulla natura delle sostanze chimiche contenute nei tessuti biologici esaminati. Si eseguono quindi una o più reazioni chimiche, stechiometricamente esatte e specifiche, che mettono in evidenza un determinato gruppo funzionale o un particolare ione, presenti nei vari tessuti e nelle cellule che li compongono. Si eseguono solitamente “batterie di reazioni” in modo da avere, oltre al dato morfologico, più risposte che, alla fine, dovranno essere univoche e incontrovertibili. I precipitati colorati così ottenuti saranno evidenti al microscopio ottico o, nel caso si tratti di fluorocromi, al microscopio a fluorescenza.
McManus-Hotchiss (PAS reazione)
Questa è una reazione specifica per la rilevazione delle mucine neutre in tessuti come gli epiteli secernenti, le ghiandole endocrine, il sistema nervoso. Viene impiegato un ossidante, in questo caso l’acido periodico, che attacca selettivamente il gruppo funzionale amminico primario o quello -OH, provocando la liberazione di un gruppo aldeidico rivelato poi dal reattivo di Shiff (rosso porpora). Si esegue normalmente in associazione all’Alcian blu.
Figura S27. Orecchio interno di embrione umano. Ossificazione indiretta. Il tessuto osseo è colorato in magenta per la forte presenza, come in tutti i connettivi, di glicosaminoglicani neutri. La cartilagine, anche se in degenerazione, è invece colorata in blu per il forte contenuto di glicosaminoglicani acidi. Alcian-Pas 100x
Alcian blu
È una reazione importante per evidenziare, qualitativamente e quantitativamente, sia le mucine acide solforate che i glicosaminoglicani (GAG) contenenti gruppi carbossilici. Di solito si esegue in contemporanea alla PAS reazione, per avere un quadro completo delle mucine presenti nel preparato, sia acide (Alcian, precipitato blu intenso), sia neutre (PAS, rosso). Se la reazione avviene in ambiente fortemente acido (pH 1) si mettono in evidenza solo i mucopolisaccaridi solforati, se avviene in ambiente mediamente acido (pH 3) anche quelli carbossilici.
Figura S28. Ossificazione indiretta in un embrione umano. La cartilagine è colorata in blu intenso per la presenza di glucosamminoglicani acidi. Alcian blu 63x
Reazione di Feulgen
È una reazione istochimica che mette in evidenza il DNA con un colore magenta. L’idrolisi, in stufa a 60°C, avviene con HCl 1N e la sua durata varia a seconda del fissativo precedentemente usato, dal tipo di tessuto e dalla specie animale. Questo è, infatti, il punto critico della reazione perchè con l’idrolisi a caldo si verifica la separazione delle basi puriniche, con conseguente formazione di gruppi aldeidici, colorati con il reattivo di Shiff in magenta. Se l’idrolisi viene prolungata oltre il tempo ottimale vengono allontanati anche gli istoni e gli acidi apurinici aumentando così la reazione nel liquido di idrolisi e facendo apparire i cromosomi sempre meno colorati. Questa reazione è altamente specifica perchè non si conosce nessun’altra sostanza cellulare, in queste condizioni, capace di formare un composto colorato con il reattivo di Shiff.
Figura S29. Fegato di topo. Reazione di Feulgen per lo smascheramento del DNA. Feulgen 100x
Reazione di Hillarp
La reazione di Hillarp per le cellule cromaffini è una reazione specifica per le catecolamine che sono presenti, per esempio, nelle cellule della midollare del surrene (secernenti adrenalina e noradrenalina). Queste sostanze hanno la proprietà di essere facilmente ossidate dal bicromato formando un pigmento insolubile bruno-marrone.
Figura S30. Surrene umano. Le cellule cromaffini della midollare del surrene sono colorate in marrone. Hillarp 100x